Che cosa è l'elettroforesi del Gel?

Che cosa è l'elettroforesi del Gel?

Elettroforesi del gel è un metodo di separazione, identificazione e caratterizzazione di miscele di proteine o acidi nucleici. Denaturato campioni la migrazione dopo l'applicazione di energia elettrica in un gel sottile, bagnato in genere effettuato in poliacrilamide o agarosio. I campioni separati sono macchiati quindi possono essere visti. Elettroforesi del gel è usata nella ricerca degli acidi nucleici e proteine e negli ospedali per identificare proteine insolite o modelli del DNA per diagnosticare malattie, difetti genetici e relazioni genetiche.

Preparazione del campione

Quando un detergente come dodecylsulfonate di sodio (SDS) viene aggiunto a una proteina o acido nucleico, il detersivo verrà associare e spiegare (denaturati) proteine e acidi nucleici. Denaturazione delle proteine rende più semplice determinare il loro peso molecolare nell'elettroforesi. La quantità di campione richiesto è in genere da 100 a 500 nanogrammi per banda campione per proteine e 5 a 100 ng per banda per gli acidi nucleici in un volume totale di circa 25-40 microlitri.

Gel

Un gel, in genere fatto di poliacrilamide o agarosio, può essere preparato o acquistato per separare queste proteine. Il gel è molto simile a gelatina. Esso è principalmente l'acqua, ma è abbastanza solido per la movimentazione. I gel contengono buffer per controllare il pH. Il gel è molto sottili (1-2 millimetri) e rettangolare. Un lato apparirà come un pettine con un sacco di denti mancanti. Le lacune sono chiamate pozzi.

Caricamento del campione

Uno posti il gel in una camera con buffer e proteine denaturate vengono aggiunti ai pozzetti. Campioni dei pesi molecolari noti vengono aggiunti ai pozzetti esterni. Gel sono realizzati con diverse quantità di poliacrilammide. Una resistenza del gel basso (4 per cento) è meglio per la separazione di molecole ad alto peso molecolare, mentre una più alta forza di gel (12 per cento) viene utilizzata per le molecole di peso molecolare più elevati. Un gel di pendenza varia la resistenza del gel e può separare una vasta gamma di proteine con la perdita di qualche risoluzione.

Elettromigrazione

Con l'applicazione di una tensione elettrica elevata, le proteine denaturate muovono verso il fondo del pozzo. Maggiore il peso della proteina, il più lento si muove. Quando l'elettricità è spenta, le proteine smettere di muoversi. Uno rimuove il gel dalla camera e le rocce in un piatto con la tintura. Coloranti organici come Coomassie coloranti blu o metallo sono usati per macchiare le proteine mentre coloranti fluorescenti quali il bromuro di etidio sono utilizzati per gli acidi nucleici.

Analisi dei risultati

Con la rimozione di macchie in eccesso, si vede che miscele separano in bande che assomigliano a scale. La posizione delle bande è confrontata con la distanza spostata dalle norme per determinare il peso molecolare del campione in ogni banda. Il gel può essere disidratato con alcool e asciugato così può essere salvato. L'intensità del colore della band quindi può essere misurata per determinare la concentrazione della proteina in ogni banda.

Sviluppo di un protocollo

Protocolli standard sono disponibili per lavorare con proteine ben noti. Se un ricercatore sta lavorando con un campione sconosciuto, la resistenza del gel, tipo di buffer, tampone pH, tensione, tempo di esecuzione, e macchia può tutti hanno bisogno di essere ottimizzato per ottenere il miglior segnale e separazione.

Protocolli